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Realizada entre 1.613-1.617. Planta de tres naves con girola, trascoro y sin crucero marcado en planta. Construida por Fray Alberto de la Madre de Dios. El retablo mayor es barroco y posee tallas de Juan de Ávila.

La sillería del coro junto con la cajonería de la sacristía fueron trazadas por Juan Gómez de Mora.

Destaca por su solemnidad la estatua orante en bronce, D. Cristóbal del Rojas y Sandoval, Arzobispo de Sevilla, comenzada por Pompeo Leoni y acabada por Juan de Arfe en la línea de las esculturas regias del Escorial.

Sobresalen dos magníficos órganos de 1616 del organero real D. Diego Quijano.

En la sacristía destaca la mesa taraceada regalo del Papa Paulo V, así como ricos paños y ornamentos donados por el Duque, y diversas pinturas de la época.